Os testes diagnósticos de COVID-19

Nasofaringe (1)

Texto escrito pela colaboradora Lais Baptista

A essa altura todos já devem conhecer a estrela do momento, o novo coronavírus (Sars-Cov-2), causador da doença Covid-19. Neste post, vamos analisar os principais testes diagnóstico do COVID-19, mas primeiro vamos ver uma pequena ficha sobre o vírus. A família dos coronavírus é uma família caracterizada por terem picos em suas membranas que lembram uma coroa. Os diferentes vírus dessa família infectam humanos e animais e causam uma série de doenças. Em humanos, essas doenças são respiratórias e variam de resfriados simples a SARS (síndrome respiratória aguda grave).

O Sars-Cov-2 é uma cepa que ainda não havia se manifestado em humanos. O espectro clínico da Covid-19 é muito amplo, inclui sintomas como tosse, dificuldade em respirar e febre. Nos casos mais graves, pode ocorrer pneumonia, síndrome respiratória aguda grave, insuficiência renal e morte.

A transmissão do Sars-Cov-2 é feita primariamente pelo contato com secreções contaminadas, como gotículas de saliva, espirro, tosse, catarro. O período de incubação (tempo entre exposição ao vírus e aparecimento dos sintomas) varia entre um a 14 dias, sendo cinco dias o tempo mais comum.

Idosos, crianças, gestantes, pessoas com imunidade baixa, pessoas com doenças cardiovasculares ou doenças crônicas como hipertensão e diabetes são considerados grupos de risco. Ser do grupo de risco significa ter uma chance maior de desenvolver um quadro grave da doença.

Caso haja contaminação, primariamente existe um aumento da carga viral circulante, que pode ser detectada em diversos espécimes biológicos (qualquer material de origem humana para fins de diagnóstico). Após a replicação e instalação viral, o organismo inicia mecanismos de defesa para conter a infecção. As primeiras classes de anticorpos produzidas durante uma resposta imune são a imunoglobulina M (IgM) e imunoglobulina A (IgA), que logo são substituídas pela produção de imunoglobulina G (IgG), que pode persistir por anos.

Teste Rápido (1)

Os testes imunológicos para a COVID-19, incluindo os testes rápidos, são imunoensaios qualitativos que consistem na detecção de antígenos e anticorpos das classes IgA, IgM e/ou IgG específicos contra o Sars-Cov-2 em amostra de sangue total, soro ou plasma. Já os testes moleculares são altamente específicos, e detectam o material genético do vírus, que é composto por RNA. Estes testes são comumente realizados em amostras de escarro, ou secreção coletada das regiões da orofaringe e nasofaringe e traqueia.

Os testes imunológicos

Os testes imunológicos são aqueles que utilizam a resposta imune para detectar da doença. A maior parte deles busca detectar os anticorpos criados pelo corpo. Por conta disso, só podem ser realizados alguns dias após o aparecimento dos sintomas, mas podem ser feitos mesmo depois da cura do paciente. Eles são divididos em testes rápidos (imunocromatográficos) e testes laboratoriais. Testes imunológicos podem detectar na amostra o antígeno em questão (nesse caso uma parte do vírus Sars-Cov-2) ou anticorpos específicos para o antígeno. Essa amostra pode ser de sangue, soro, plasma.

Testes rápidos são aqueles que, como diz o nome, são rápidos. Por definição, são testes que o resultado sai em até 30 minutos. Testes rápidos são comumente usados para muitas coisas, de detecção do vírus do HIV até determinação de gravidez. No caso dos testes rápidos para o coronavírus, são dispositivos de uso profissional, manuais, de fácil execução e que não necessitam de outros equipamentos de apoio (como os que são usados em laboratórios). Até o dia 21/05/2020, a Anvisa tinha aprovado 62 testes rápidos para o diagnóstico da Covid-19.

Nos testes rápidos, o antígeno ou o anticorpo é fixado em uma membrana na forma de linhas ou pontos e o restante da membrana é bloqueado. Se estivermos procurando o antígeno, fixamos o anticorpo, e vice-versa. Quanto mais específica for a conexão antígeno-anticorpo utilizada, melhor a capacidade de detecção do teste.

Para a visualização do resultado, um segundo anticorpo ligado a corante é empregado. Ele é específico para o complexo antígeno-anticorpo. Com a agregação dos complexos na linha de resultado, a linha vai sendo “tingida”. A intensidade de cor da linha teste poderá variar de acordo com a concentração presente na amostra. Porém, qualquer intensidade de cor na linha teste indica resultado positivo.

Para garantir a qualidade dos testes, todos os testes rápidos incluem uma área de controle. Na linha controle, que vem após a linha de teste, há anticorpos contra o anticorpo conjugado com corante. A linha “positiva” do controle sempre tem que aparecer, para garantir que o procedimento foi feito de forma correta e a qualidade dos reagentes utilizados.

Os testes laboratoriais são rápidos, embora não dentro da definição de teste rápido. Até o dia 22/04/2020, a Anvisa tinha aprovado 18 testes imunológicos laboratoriais para o diagnóstico da Covid-19. Os testes aprovados usam diferentes metodologias: ELISA (09), imunoensaio quimioluminescente (04), imunofluorescência (03), eletroquimioluminescência (01) e micropartículas por quimioluminescência (01).

Todas essas metodologias também buscam detectar a interação entre anticorpo e antígeno e usam luz para interpretar o resultado. Alguns usam emissão de luz por meio da partícula, outros precisam de uma emissão de luz específica sobre a amostra para acontecer a reação visível. Além do tempo que demoram, a diferença para os testes rápidos é que a leitura e análise do resultado normalmente são feitas por uma máquina, tornando assim o processo menos subjetivo.

O teste molecular

Até o momento, o teste molecular que utiliza a Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (RT-PCR) permanece como padrão de referência para o diagnóstico definitivo na fase aguda da COVID-19, por meio da detecção de RNA viral em secreções respiratórias.

As PCRs são reações muito usadas na biologia molecular. Elas permitem que seja analisado um pedacinho específico do material genético (DNA/RNA) mesmo que ele esteja em pouca quantidade na amostra. Primeiramente, pega-se a amostra e se faz uma extração específica para DNA ou RNA. Dessa forma, a gente está purificando a amostra e deixando somente o material base do que queremos analisar.

Ao preparar a reação, misturamos enzimas, catalisadores e bases nitrogenadas (que são os tijolos que formam o DNA e RNA). Além disso, também adicionamos um “molde” complementar ao que queremos encontrar na amostra (o iniciador). Se o material genético alvo estiver presente, esse molde vai se ligar e chamar as enzimas que vão fazer a reação de cópia. Durante a PCR, essa parte que queremos analisar vai ser copiada muitas vezes. É uma reação exponencial, o que significa que mesmo que no começo tenhamos somente algumas cópias, no final teremos centenas de milhares.

Certo, agora a gente tem um tubinho com muitas cópias do material que queremos analisar. Essa análise posterior normalmente é feita com eletroforese (uma técnica que divide a amostra por peso/tamanho). Mas a vantagem da RT-PCR é que é em tempo real. Então a análise acontece ao mesmo tempo que a amplificação.
Lembram que para a amplificação a gente adicionou as bases nitrogenadas? Na RT-PCR, algumas dessas bases são marcadas com fluorescência. Então à medida que elas são adicionadas numa “parede” nova, elas liberam essa fluorescência, que é lida pela máquina.

Por conta do processo de amplificação que a amostra está passando, é possível detectar mesmo quantidades pequenas de vírus, como é comum no começo da infecção ou em pessoas assintomáticas. Até o dia 21/05/2020, a Anvisa tinha aprovado 26 testes de RT-PCR para o diagnóstico da Covid-19.

Rt Pcr (1)
 
Prós e contra

A resposta imunológica depende de fatores individuais, sendo assim, a produção de anticorpos pode ser mais precoce ou mais tardia. Os artigos que descrevem a resposta imunológica ao COVID-19 ainda são muito limitados, mas acredita-se que os anticorpos sejam detectáveis a partir do 7º dia de doença.

A utilização dos testes rápidos tem alta relevância em momentos de surto. Quando os recursos são escassos, eles podem ser utilizados como filtro populacional. Os testes imunológicos têm como principais vantagens a pouca infraestrutura laboratorial exigida, a rapidez de realização e a possibilidade de se fazer um inquérito epidemiológico maciço. Já a técnica de RT-PCR exige infraestrutura laboratorial robusta e especializada, e seu tempo para realização é de, no mínimo, 6 horas.

Os testes imunológicos possuem sensibilidade variável, mas geralmente podem ser realizados após 7-10 dias da infecção. Há o risco de resultados falso negativos caso sejam realizados muito precocemente ou por falta de especificidade do teste com os anticorpos do paciente. Também existe o risco de falso positivo por reação cruzada com outros coronavírus que causam infecções humanas, e em infecções causadas pelo citomegalovírus (CMV) e vírus Epstein-Baar (EBV). O desempenho dos testes rápidos é inferior aos testes realizados em plataformas analíticas como ELISA e quimioluminescência.

O melhor momento para a realização de um teste molecular ainda não está definido, acredita-se que na fase aguda sintomática a sensibilidade seja maior e por isso sugere-se que seja coletado nos primeiros dias de sintomas. A partir do sétimo dia, a chance do resultado vir positivo é menor.

Os maiores problemas relacionados ao exame molecular envolvem: coleta complicada, o que pode gerar a uma amostra coletada de forma errada; o paciente apresentar pouco vírus, ficando abaixo da capacidade de detecção da máquina; e coleta de amostra no momento errado (muito cedo ou muito tardiamente). Todos esses cenários podem levar a um falso negativo.


REFERÊNCIAS

http://portal.anvisa.gov.br/informacoes-tecnicas13/-/asset_publisher/WvKKx2fhdjM2/content/prioridade-de-analise-em-situacoes-de-aumento-da-seguranca-de-uso-dos-produt-1/33912?redirect=%2Fprodutos-para-a-saude&inheritRedirect=true (acessado 21/05/2020)

http://portal.anvisa.gov.br/noticias/-/asset_publisher/FXrpx9qY7FbU/content/testes-para-covid-19-perguntas-e-respostas/219201/pop_up?_101_INSTANCE_FXrpx9qY7FbU_viewMode=print&_101_INSTANCE_FXrpx9qY7FbU_languageId=pt_BR (acessado 22/04/2020)

https://www1.folha.uol.com.br/equilibrioesaude/2020/01/veja-o-que-se-sabe-ate-agora-sobre-o-coronavirus-chines.shtml (acessado em 10/04/2020)

Orientações Técnicas Sobre O Diagnóstico Da Covid-19, disponível em https://www.mypardini.com.br/noticias/orientacoes-tecnicas-sobre-o-diagnostico-da-covid-19/ (acessado em 22/04/2020)

Imunocromatografia, disponível em https://www.biomedicinapadrao.com.br/2012/06/imunocromatografia.html (acessado em 14/05/2020)

Telelab, aula sobre testes rápidos, disponível em https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22198/mod_resource/content/1/S%C3%ADfilis%20-%20Manual%20Aula%207.pdf (acessado em 22/04/2020)

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